国家药典委员会PCR法标准草案修订 - 新增实时荧光定量PCR法作为第二法，补充定量检测技术 [2][7] - 修订常规PCR法，增加OD260/OD280等核酸质控要求，明确方法适用性参数（序列、退火温度、酶切条件等） [7][14] - 标准草案公示期90天（2025-05-21至2025-08-19），业务编号通辅包20250013 [5] 常规PCR法技术规范 - 仪器要求包括PCR仪、电泳仪、紫外凝胶成像仪等 [14] - 体系组成需含耐热DNA聚合酶(1-2.5U)、dNTP(各200μmol/L)、引物(100-500nmol/L) [19] - 扩增程序含预变性(94℃ 3-5分钟)、30-40次循环，退火温度45-65℃ [19] - 新增DNA特征序列作为质控标记，列举乌梢蛇、川贝母等中药材特征序列 [16][17] 实时荧光定量PCR法新增内容 - 采用染料法或探针法，用于生物制品核酸定性/定量检测 [25] - 要求仪器具备荧光激发和实时读取功能，激发/发射波长需匹配 [25] - RNA模板需满足OD260/OD280 1.8-2.1，逆转录为cDNA后使用 [27] - 标准曲线需5个对数级浓度，扩增效率85%-110%（斜率-3.10~-3.74） [28] 实验室与质量控制要求 - 需分区管理试剂配制、模板制备、扩增分析等环节 [22] - 琼脂糖凝胶浓度按产物大小选择（1-3%对应<1000bp，0.5-1.5%对应≥1000bp） [19][23] - 实时荧光PCR实验室需符合CNAS-GL029气压控制标准 [30]