研究核心突破 - 研究突破了LINE-1逆转座子ORF2p蛋白体外纯化与功能研究的瓶颈 [3] - 解析了ORF2p进行RNA逆转录以及识别多样性RNA底物的作用机制 [3] - 揭示了ORF2p靶向切割基因组DNA以及LINE-1转座与细胞复制偶联的分子原理 [3] 研究方法与发现 - 在真核细胞中表达并纯化了人类ORF2p与其内源性核酸形成的复合物 [4] - 通过冷冻电镜分析发现共纯化核酸有两种片段：A型RNA/DNA杂交体和B型带有单链尾部的双链DNA [5] - ORF2p缺乏序列特异性DNA结合的决定因素 其内切酶结构域通过灵活连接与dsDNA结合区域相距较远 [5] - 共纯化的DNA测序显示富含重复的卫星DNA元件 RNA测序表明ORF2p能结合并逆转录多种细胞RNA [5] ORF2p内切酶活性机制 - ORF2p对具有叉状或悬突结构的DNA底物的内切酶活性显著增强 [6] - 高效切割位点位于携带TTTTT/AA共有序列的切割基序5'方向约6-10个碱基对处 [6] - 对另一条链的切割主要发生在距离该基序8-12个核苷酸的TA TC和TG二核苷酸之间 [6] - 对两条DNA链的切割导致8-12个核苷酸的交错侧翼偏移 解释了LINE-1整合时靶位点重复的产生 [6] 研究意义与结论 - 发现ORF2p是一种结构依赖性内切酶 结合于切割位点上游的双链DNA区域并识别下游叉状或翼状结构以实现高效DNA切割 [7] - 表明LINE-1的逆转座过程可能利用染色体生物学过程中产生的非经典DNA结构中间体来实现基因组入侵和重排 [7] - 这些发现深化了对逆转录转座分子机制的理解 为研究基因组动态变化和进化提供了重要见解 [7]