蛋白质定向进化技术 - 传统方法如易错PCR存在耗时长、效率低、突变库多样性受限等问题 [2] - 基于CRISPR-Cas或T7 RNA聚合酶的突变系统面临突变范围小、宿主普适性窄等挑战 [2] - 非模式生物(如嗜盐单胞菌)缺乏高效蛋白质定向进化工具 [2] 正交转录突变系统(OTM)设计 - 融合三种噬菌体RNA聚合酶(MmP1/K1F/VP4)与两种脱氨酶(PmCDA1和TadA变体) [3] - 通过RNA聚合酶解旋DNA形成单链区，脱氨酶编辑单链DNA实现C:G-T:A和A:T-G:C突变 [3] - 采用XTEN柔性连接肽构建正交转录突变元件 [3] - 添加尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)使突变效率提升150万倍，脱靶率仅增加65倍 [3] 系统优化与功能扩展 - 构建双功能突变元件可同时引入C:G-T:A和A:T-G:C突变 [4] - 目标基因上下游插入噬菌体启动子实现突变均匀分布 [4] - 不同噬菌体RNA聚合酶元件特异性识别各自启动子，避免交叉干扰 [5] 宿主适用性与应用表现 - 在非模式生物(嗜盐单胞菌)和模式生物(大肠杆菌)中均表现优异 [5] - 突变荧光蛋白和色素蛋白获得多种颜色细胞 [5] - 突变细胞骨架蛋白获得超长杆状、球形等工程菌株 [5] - 一轮突变进化σ70全局转录调控因子RpoD和赖氨酸外排蛋白LysE [5] 技术优势与前景 - 1天内完成传统需数周的蛋白质优化过程 [6] - 突变效率较自发突变提升150万倍 [3][6] - 未来可整合其他脱氨酶丰富突变库多样性 [6] - 可应用于加速生物制造(如PHA生产)关键酶优化 [6]