先导编辑器技术概述 - 先导编辑器是一种基于CRISPR系统的新一代基因编辑工具，由刘如谦教授团队于2019年开发[3] - 该技术相比CRISPR-Cas9更精准，脱靶效应更少，无需造成DNA双链断裂，而是利用改造的Cas9切口酶切开DNA双链中的一条进行编辑[3] - 理论上能够修复75000种已知致病性人类遗传突变的89%[3] 先导编辑器的工作原理 - 先导编辑器由逆转录酶和Cas9切口酶融合蛋白以及一条pegRNA组成[5] - 编辑过程始于与基因组靶点结合并形成单链DNA切口，被切开的3‘ DNA与pegRNA模板配对，由逆转录酶启动将模板序列写入3’ DNA的延伸部分[5] - 此过程可适用于DNA的替换、插入和删除等多种编辑类型[5] 先导编辑器的技术挑战 - 新DNA链必须与旧DNA链竞争整合到基因组，旧链胜出可能导致新链上多余DNA部分意外整合到其他位置，产生错误[3] - 最新版本先导编辑器大约每编辑7次到121次就会出现一次错误[3] - 错误类型包括因预期编辑未达成而产生的插入/缺失突变，可能导致不可预测且有害的DNA序列[5] 下一代先导编辑器vPE的突破 - 麻省理工学院Robert Langer团队通过对Cas9蛋白修饰，开发了下一代先导编辑器vPE，大幅降低基因组编辑错误概率[4] - vPE通过考察可诱导切口末端降解的Cas9切口定位松弛突变进行工程化改造，意外发现对indel错误产生有显著影响[7] - 与之前先导编辑器相比，vPE的indel错误率降为原来的1/60，编辑543次才会出现一次indel错误[9] - vPE未让递送系统复杂化，也没有增加额外步骤，实现了更精确的编辑[4]

同义突变的生物学效应研究 - 传统观点认为同义突变在进化中是中性的，但2022年密歇根大学张建之团队在Nature发表论文指出酿酒酵母的同义突变大多是非中性的，会破坏细胞适应性[2] - 早期研究显示病毒和原核生物中的同义突变可能影响其适应性[2] - 这些发现在非真核生物和酵母中的结论是否适用于哺乳动物和人类尚不清楚[3] PRESENT高通量筛选技术 - 北京大学魏文胜团队开发了PRESENT技术，利用先导编辑研究人类基因组中的功能性同义突变[4] - 该技术基于刘如谦2019年开发的先导编辑系统和2021年增强版PEmax系统[7] - 研究构建了包含297900个epegRNA的文库，靶向3644个人类蛋白质编码基因进行大规模筛选[7] 研究发现 - 群体层面分析显示同义突变与非同义突变在适应度效应方面存在差异，但表型分布相似[9] - 只有很小一部分同义突变显示出可检测的效果[9] - 团队开发了DS Finder机器学习模型，揭示同义突变对mRNA剪接、转录等生物过程的影响[9] 技术应用 - 将单细胞筛选方法与PRESENT技术集成，命名为DIRECTED-seq[7] - 研究发现同义突变能改变RNA折叠方式并影响翻译，如PLK1_S2案例[9] - 结合筛查数据和模型可预测具有临床危害的同义突变[9]